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各型尿道下裂尿道板及包皮中HoxA13的分布研究

  尿道下裂是由于胚胎时期外生殖器发育异常、尿道板未能正常融合所致。目前尚不清楚其发病机制,可能是环境因素与基因相互作用的结果。

 

  Parker等研究发现HoxA13基因突变多出现在手-足-生殖器畸形中,因而推测HOX基因可能与泌尿生殖系统畸形发生有关。本次实验主要是研究不同类型尿道下裂患儿尿道板及包皮中HoxA13基因转录及其蛋白表达,探讨其与尿道下裂严重程度的相关性,以期了解HoxA13在尿道下裂发生机制中的作用。

 

  1资料和方法

 

  1.1资料选择从2012年3~9月本院手术治疗的尿道下裂患儿30例,其中前型10例(阴茎头型3例、冠状沟型3例、冠状沟下型4例),中间型10例(阴茎远段型3例、阴茎中段型3例、阴茎近段型4例),后型10例(阴茎阴囊型4例、阴囊型3例、会阴型3例)。年龄在3.3~11.6岁,平均7.5岁,无其他泌尿生殖系畸形及其他系统的病变与畸形,所有入组病例此前均未接受手术或激素治疗。手术中取其背侧的包皮组织100~150mg与腹侧异位尿道口处尿道板约3mm。另选10例包茎患儿为正常对照,年龄3.1~10.4岁,平均6.8岁,收集其背侧包皮组织。10例阴茎癌患者取其尿道为正常对照,年龄48.1~75.6岁,平均61.9岁。将所得每份组织一式2份,分别置于液氮,多聚甲醛中保存。

 

  1.2主要试剂与仪器总RNA提取试剂TRIzon,cDNA第一链合成试剂盒(美国ThermoScientific公司);2×TaqMasterMix;兔抗人HoxA13多克隆抗体(美国SantaCruz公司);羊抗兔IgG(武汉博士德公司);DAB-H2O2显色试剂盒(武汉博士德公司);ep-pendorf梯度PCR仪,UVP凝胶成像分析系统,O-lympus-PMTVC数码图像采集系统,Image-ProP1us4.1图像分析软件。

 

  1.3实验方法

 

  1.3.1RNA提取及cDNA合成取冻存组织50~80mg置于液氮预冷的无菌研钵中,按照TRIzol操作说明提取RNA,经核酸蛋白测定仪测定A260nm/A280nm比值与浓度并行RNA电泳,鉴定RNA纯度及完整性。取1μg总RNA进行逆转录,反应体系20μl,按照说明书操作,所得cDNA经核酸蛋白测定仪测定其浓度,并置于-20℃冻存备用。

 

  1.3.2RT-PCR引物HoxA13,GAPDH由PrimerPrimer5序列应用软件设计,南京金斯瑞生物科技有限公司合成。反应体系15μl进行扩增。HoxA13上游:5'-AAATGTACTGCCCCAAAGAGCA-3',下游:5'-ATCCGAGGGATGGGAGACC-3';GAPDH上游:5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3',下游:5'-CGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。反应条件:95℃15min;95℃30s;60℃30s;72℃1min;72℃7min。

 

  1.3.3免疫组化

 

  将4%多聚甲醛固定的组织进行常规石蜡包埋切片,切片厚5μm。经脱蜡、抗原修复,封闭,滴加兔抗多克隆HoxA13抗体(1∶200)于4℃孵育过夜,加羊抗兔IgG抗体、ABC、DAB-H2O2显色20min,电子显微镜观察。用已知阳性片作对照,PBS代替一抗作空白对照。

 

  结果判定:按照细胞质有阳性着色即为阳性细胞进行分析,显微镜200倍放大拍照,Image-ProP1us4.1软件分析累计光密度(IA)。

 

  1.4统计学分析

 

  应用GraphPadPrism4软件进行统计学分析,计量资料用x&viewmn;s表示,多组均数比较采用Kruskal-WallisH检验,两两比较用Mann-WhitneyU检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

 

  2结果

 

  2.1RT-PCR的特异性

 

  PCR产物凝胶电泳显示目的条带与内参都只有一条,且分子大小符合,无其他杂带。

 

  2.2包皮和尿道板中

 

  HoxA13mRNA相对定量分析尿道下裂与对照组中都有HOXA13的转录,相对于内参的表达水平,对照组明显高于中型和后型,前型的表达水平也明显高于后型,见表1和图1。

 

 图1   HoxA13 mRNA 在各类型尿道下裂中患者包皮与尿道板组织的表达

  HoxA13 mRNA 在各类型尿道下裂中患者包皮与尿道板组织的表达
 

表1    包皮与尿道板中 HoxA13/GAPDH 的表达量

包皮与尿道板中 HoxA13/GAPDH 的表达量

  2.3包皮和尿道板中HoxA13蛋白的表达

 

  光学显微镜下观察可见HoxA13蛋白定位表达于包皮表层,主要在基底层细胞中,阳性为胞质黄染,呈颗粒状。对照组包皮组织中HoxA13蛋白集中表达于表皮层尤其是在基底层细胞中,呈阳性或强阳性;而尿道下裂组中HoxA13蛋白散在或零星状分布于表皮层且呈阴性或弱阳性。对照组尿道组织中,HoxA13蛋白表达多、分布密集,多分布于尿道表皮分化成层状的鳞状表皮中的基底细胞。而在尿道下裂的尿道板中,HoxA13蛋白零星分布,主要表达于尿道板表皮分化成层状的鳞状表皮中的基底细胞,在移行细胞层里少有表达。移行细胞层鳞化的程度可能与尿道异位开口位置有关,位置越靠近尿道外口鳞化越多。对照组明显高于中型和后型,前型的表达水平也明显高于后型,见表2和图2~3。

 

表2     包皮和尿道板中 HoxA13 蛋白累计光密度

包皮和尿道板中 HoxA13 蛋白累计光密度
 
 
图2    包皮组织中 HoxA13 的表达
包皮组织中 HoxA13 的表达
 
图3     尿道板组织中 HoxA13 的表达
尿道板组织中 HoxA13 的表达

 

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